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  • 凝胶过滤膜的新用途-赛多利斯实验室

    [2019/3/26]

    通过使用水溶性12602 Sartorius Stedim Biotech凝胶过滤膜采集病毒,在德国格赖夫斯瓦尔德的一家儿童综合诊所检测经空气传播的甲型(H3N2)流感病毒。

    引言

    虽然基于撞击原理撞击采集器早就证明了其采集微生物气溶胶的可靠性,但是随着水溶性凝胶过滤技术的发展以及这种过滤膜仅在采集细菌气溶胶方面广泛的应用,直到总部位于哥廷根的赛多利斯斯泰帝生物技术有限公司开始商业化生产这种凝胶过滤膜之后,才使得过滤法在最近获得越来越多的关注。

     

    迄今为止,凝胶膜用于检测和采集病毒气溶胶的价值被认为是有限的,且凝胶膜还可以用于采集稳定的抗性病毒(如果有用的话)。截止到目前,这方面的实验数据都非常少。

     

    Jaschhof团队使用Sartorius Stedim Biotech凝胶过滤膜(12602)对通过实验产生的T1和T3大肠杆菌噬菌体和A|PR|8|34(H1N1)流感病毒的静止气溶胶进行采集,对这些病毒的采集实现了恒定的采集效率,即使在高入口速度(最高达1.6m/s)和延长采集时间(最长15分钟)的条件下也是如此。


    凝胶过滤膜对机械应力的高耐性和已证实的流感病毒的稳定性是在1990年初(第3-5周)急性呼吸道疾?。ˋRD)发病呈季节性上升期间测试该方法在实践中有效性的原因。本研究建立在通过实验产生的病毒和噬菌体气溶胶的测试结果基础上。

     

    在格赖夫斯瓦尔德儿童综合诊所的候诊室内抽取空气样本3天,然后将水溶性过滤材料用于病毒培养实验。平行进行了实验,培养从候诊室中新患有急性呼吸道疾病的儿童抽吸获得的鼻分泌物中分离的病毒。


    材料和方法

    研究地点

    格赖夫斯瓦尔德儿童诊所的候诊室(约120 m³),两个小时内最多有在父母陪同下的57名儿童(1990年1月24日)。温度:25°C,60% 相对湿度。


    实验 | 测试材料:

    新患有急性呼吸道疾病儿童的鼻分泌物。凝胶过滤膜,12602,过滤1.8m³的室内空气后。然后将其与5ml等渗缓冲液一起密封在聚乙烯袋中,用于在pH 7.4下用0.5%酵母提取物(Difco)、青霉素G(400μl/ml)和链霉素(400μg/ml)进行细胞培养。

    所有样本在4小时内进行处理(期间储存在冷却室中)。

    流感病毒A|PR|8|34(H0N1)的扫描电子显微照片。

    来自11天龄胚胎鸡蛋培养物的病毒,经蔗糖密度梯度纯化。

    显微照片:Herrmann|Fischer


    空气取样

    通过Sartorius Stedim Biotech凝胶过滤膜(12602-050)采集15分钟,每个过滤膜(120 I/min)的样本经3天过滤1.8m³的空气获得。


    病毒学分析

    鼻分泌物:加入汉克氏溶液(每个样本3ml),将样本离心30分钟(3,000rpm),每毫升上清液添加10μl抗生素溶液,在室温下培育1小时。用这些标本接种10天龄孵育蛋的羊膜,在33℃下孵育3天;准备3个无标记次培养;HAT用于检测病毒。


    空气样本:过滤膜在37℃的水浴中液化5分钟;将上述抗生素溶液加入到用于接种孵育蛋的溶液中;然后培养FL细胞和腹水肿瘤细胞;根据HAT、CPE和HAdT的常规技术检测病毒。


    通过在HAHT中采用兔流感病毒免疫血清 A|格赖夫斯瓦尔德|1|89(H1N1)和A|格赖夫斯瓦尔德|1|90(H3N2)以及流感病毒A|四川|2|87(H3N2)和流感病毒A|格赖夫斯瓦尔德|2|88(H3N2)的抗原进行交叉滴定,对从鼻分泌物和空气样本中分离出的流感病毒进行归类和鉴定。

     

    通过PAGE测定v-RNA和病毒蛋白质图谱。


    结果与讨论

    从1990年1月24日采集的实验材料中,在第三次传代培养的孵育卵中成功接种从鼻分泌物中分离的三种类型的病毒和从空气样本中分离的甲型流感病毒(流感病毒A|格赖夫斯瓦尔德|2|90[H3N2])。


    HAT显示分离的病毒和变体A|格赖夫斯瓦尔德|2|88和A|四川|2|87的抗原在很大程度上是相关的,与使用凝胶膜进行空气取样时从候诊室内的患者身上所取的鼻分泌物标本培养的菌株无任何差异(流感病毒A|格赖夫斯瓦尔德|1|90[H3N2])。

     

    分离的病毒蛋白(HA、NP、NS和M)及其v-RNA的所有条带在PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)后的迁移率高度匹配(图1)。使用细胞培养物尝试从空气样本中进一步分离病毒未成功。

    图 1:

    在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)时,从流感病毒A|格赖夫斯瓦尔德|1|90(H3N2)(从患者标本中分离)和流感病毒A|格赖夫斯瓦尔德|2|90(从空气中采集和分离)中分离v-RNA。三醋酸EDTA缓冲液中3.5%的聚丙烯酰胺凝胶。

     

    空气样本在急性呼吸道疾病发病流行前采集的事实证明了用于检测空气中流感病毒的过滤器采集方法的有效性。

     

    研究当天有75%的儿童(≥8岁)患有呼吸道感染,但最多只有40%的儿童出现急性卡他性症状(咳嗽、打喷嚏、流鼻涕)。在该地区急性呼吸系统疾病季节性发病率略有上升期间的儿童诊所候诊室的空气中检测到甲型流感病毒,显著证实了使用实验产生的大肠杆菌噬菌体和甲型流感病毒静止气溶胶得到的结果。


    这样首次证明了凝胶过滤器在实践中适合从空气中采集呼吸道病毒。


    展望

    考虑到简单的空气过滤方法涉及到的工作较少,这种使用凝胶过滤膜的原理必将得到越来越多的认可,有助于解答关于感染性病毒气溶胶的产生、稳定性和扩散的众多问题(例如遗传工程技术中)。

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